Инфекциозните заболявания, причинени от патогени, включително вируси, бактерии, гъбички и паразити, са класирани като втората водеща причина за смърт в света от Световната здравна организация (WHO). Въпреки огромните усилия в посока подобряване на обществено здравеопазване от миналия век насам, все още сме изправени пред редица предизвикателства за предотвратяване или изкореняване на инфекциозни заболявания. 

Много патогени могат да причинят остри инфекции, които се изчистват ефективно от имунитета на гостоприемника. Има подкатегория от тези патогени, наречена „вътреклетъчни патогени“, която може да създаде персистиращи и понякога доживотни инфекции. 

За този вид патогени вече се знае много, като някои от най-важните акценти са свързани с устройството и механизмите им. Тези патогени споделят общи специфични за патогенния тип механизми по време на взаимодействието гостоприемник-патоген вътре в клетките гостоприемник. Освен това те са еволюирали и са разливли различни стратегии за избягване на имунитета и устойчивостта към тях. Именно поради тези причини са толкова трудни за изкореняване или с други думи – пълноценно лечение. 

Поради тези и други причини диагностиката на интрацелуларни патогени се явява ключова стъпка в борбата с тях. Един от най-добрите инструменти за тази цел е EliSpot, за който ще ви разкажем подробно в материала.

Какво представляват вътреклетъчните (интрацелуларни) патогени

Концепцията за вътреклетъчен патоген класифицира патогенните микроби въз основа на тяхното място на репликация и зависимост от клетките гостоприемници. Тази концепция изиграва фундаментална роля в създаването на областта на клетъчната микробиология, основана отчасти от д-р Паскал Косарт.

Вътреклетъчните патогени живеят и се репликират или в ендозомални компартменти, или в цитозола на различни клетки гостоприемници като макрофаги, дендритни клетки, неутрофили, фибробласти, епителни или ендотелни клетки или еритроцити. Примерите включват не само всички вируси, които представляват задължителни вътреклетъчни патогени в най-строгия смисъл на думата, но също и много различни бактериални патогени, както и някои протозои и гъбички, които показват или облигатен, или поне факултативен вътреклетъчен начин на живот.

Инфекциозните заболявания, причинени от вътреклетъчни патогени, оказват огромно въздействие върху общественото здраве. Например Mycobacterium tuberculosis, Plasmodium falciparum и вирусът на човешката имунна недостатъчност, съответно причинители на туберкулоза, малария и СПИН, заразяват повече от една трета от световното население и отнемат живота на няколко милиона ежегодно. Сред най-популярните вътреклетъчни патогени се нареждат: 

• Борелия (причинители на Лаймска болест)
• Епщайн-Бар вирус (EBV)
• Цитомегаловирус
• Хламидия
• Херпесни вируси
• Микоплазма
• Аспергилус и други

Един от отличителните белези на много вътреклетъчни патогени е тяхната способност да се задържат за дълги периоди, ако не и през целия живот, в техните гостоприемници бозайници. Персистиращите инфекции обикновено започват с остра инфекция, свързана със симптоми на заболяването с различна тежест. Острите инфекции са типичен, очакван курс за бактерии като Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, и двете коменсали на носната кухина или вируси като грипен вирус и риновирус. Въпреки това, някои патогени могат да избегнат елиминирането от имунната система на гостоприемника чрез различни механизми и да причинят персистиращи инфекции, които могат да доведат до латентни инфекции през целия живот. 

За разлика от острата инфекция, персистиращата инфекция не се изчиства бързо и патогенът, геномът на патогена или протеините, получени от патогена, продължават да се произвеждат за дълги периоди от време. Например инфекциозен вирус на лимфоцитен хориоменингит или бактерии Salmonella Typhi могат да се произвеждат непрекъснато или периодично. 

При латентна инфекция, първоначалната остра инфекция е последвана от латентна фаза и повтарящи се периоди на реактивиране, което най-вече води до производство на инфекциозни агенти, но може или не да бъде придружено от симптоми. Примери за латентни вирусни инфекции включват вируса на Херпес Симплекс (Herpes Simplex) (HSV) и вируса на Епщайн Бар (Epstein-Barr) (EBV). Латентните бактериални инфекции включват Mycobacterium tuberculosis и сифилис, причинен от бактерията спирохета Treponema pallidum.

Вътреклетъчните патогени могат да приемат един от тези различни модели на инфекция в гостоприемника. Както отбелязахме и по-рано, интересно е, че много вътреклетъчни патогени процъфтяват в един от най-ефективните типове клетки за антимикробна защита, а именно макрофаги и дендритни клетки. 

При вътреклетъчни инфекции бактериалните патогени използват клетката гостоприемник като резервоар и за защита срещу терапевтични средства. Това води до персистиращи (постоянни) инфекции. Тъй като повечето антибиотици не могат ефективно да проникнат и/или да се натрупат в еукариотните клетки, лечението на вътреклетъчните инфекции представлява сериозно предизвикателство. 

След толкова задълбочена информация за същността им, ще разгледаме кои са най-често срещаните интрацелуларни патогени и кои болести причиняват.

Борелия – Лаймска болест

Чудите ли се защо е наречена “Лаймска болест”? Болестта е диагностицирана за пръв път в градовете Лайм и Олд Лайм в Кънетикът, САЩ и от там произлиза името ѝ. 

Лаймската болест или борелиоза, борелиозис бургдорфери и други наименования, е инфекциозно заболяване, причинявано от няколко различни вида бактерии от рода Борелия, сред които Борелия бургдорфери, Борелия афзелии, Борелия гаринии и други. 

Тази инфекция се предава чрез ухапване от кърлеж, заразен с бактерия от рода Borrelia. Тя е най-често срещаното заболяване, предавано от кърлежи в Северното полукълбо. Лаймската болест може да се развие през фази (етапи), които са:

• Ранно локализирана Лаймска болест (от първа до четвърта седмица).
• Ранно разпространена Лаймска болест (от първи до четвърти месец).
• Късна персистираща, късно дисеминирана или просто късна Лаймска болест (след четири месеца, дори до години по-късно).

Симптомите на Лаймска болест най-общо са следните, като могат да варират в различните етапи на инфекцията:

• Червеникав обрив или кожна лезия на ухапаното място или множество области с обрив
• Висока температура
• Главоболие
• Болки в тялото и ставите
• Умора
• Подути лимфни възли
• Невропатия и други 

Летните месеци предразполагат към ухапване от кърлежи, което може да остане незабелязано и инфекцията да прогресира. Инкубационният период може да е от 3 до 30 дни или повече. Изключително важно е навреме да се диагностицира и лекува тази болест, която иначе може да причини увреждане на кожата, ставите, сърцето и нервната система. При преглед от лекар и съмнения за Лаймска болест обикновено се назначават редица изследвания, като първата стъпка към надеждна диагностика може да бъде направена чрез EliSpot тест. Той e сред най-чувствителните (84%) и специфични методи за изследване на Т и В клетъчна активност за разлика от стандартното серологично изследване на нивата на IgM/IgG антитела, което е с около 50% чувствителност и то при ранна инфекция. 

Съществен недостатък на серологичното изследване е, че може да даде фалшиво положителен резултат, отнема много ценно време и така може да забави значително лечението. EliSpot тестът дава както качествена, така и количествена информация за дейността на Т-клетките, които започват да работят веднага след контакт с микроорганизъм и така, докато се елиминира инфекцията цялостно. Антителата от друга страна могат да останат с по-високи стойности години наред, след като инфекцията е била отстранена. 

Ето защо диагностичната стойност на кръвния тест EliSpot  е толкова голяма – той е сравнително бърз, високоефективен и високоспецифичен (94%) диагностичен метод, с който добиваме представа за Т и В клетките на имунната система.

Вирус на Епщайн-Бар (EBV)

Вирусът на Епщайн-Бар (EBV) е вирус от семейството на херпесните вируси, който може да зарази хората. EBV инфекциите са много често срещани – може вече да сте се заразили с вируса, без дори да го знаете. 

Епщайн-Бар вирусът се разпространява от човек на човек чрез телесни течности, особено слюнка.  Инфекциите с вируса на Епщайн-Бар обикновено не причиняват симптоми, но в други случаи, особено при юноши и възрастни, може да доведат до инфекциозна мононуклеоза. 

След като веднъж сте се сдобили с Епщайн-Бар, инфекцията остава в тялото през целия живот в латентно състояние, където е неактивна или “спяща”. Вирусът може да се реактивира отново при отслабване на имунната система. Това води до симптоми, независимо кога за първи път сте се заразили с EBV. 

Симптомите, когато има такива, варират по тежест за всеки човек и може да включват:

• Възпалено гърло 
• Умора или чувство на изключително изтощение
• Висока температура
• Подути лимфни възли
• Обриви по кожата 
• Увеличен далак и черен дроб

Все повече изследвания предполагат, че вирусът на Епщайн-Бар играе роля в развитието на множествената склероза и не само.  Учените са открили механизъм, който може да обясни защо вирусът на Епщайн-Бар е свързан с някои автоимунни заболявания като лупус и МС. 

Предишни проучвания са идентифицирали повече от 50 генетични области, свързани с лупус. Смята се, че повечето участват в генната регулация. Изследователи от Cincinnati Children’s Hospital Medical Center разработват изчислителна и биохимична техника, известна като RELI. Те използват RELI, за да сравнят генетичните вариации, свързани с лупус, с генетични и протеинови данни от заразени с EBV човешки клетки.

Екипът установява, че вирусен протеин, наречен EBNA2, е свързан с почти половината от генетичните региони, свързани с риска от лупус. RELI показва, че много човешки транскрипционни фактори са свързани със същите генетични региони като EBNA2.

Учените също използват RELI, за да сравни генетичните региони, свързани с риска от други автоимунни заболявания. Те откриват, че EBNA2 се свързва с региони, асоциирани с риска от множествена склероза, ревматоиден артрит, възпалително заболяване на червата, диабет тип 1, ювенилен идиопатичен артрит и целиакия. Много транскрипционни фактори също са свързани с тези региони. Тези данни предполагат, че Епщайн-Бар инфекцията води до активирането на гени, които допринасят за риска от развитие на автоимунно заболяване.

Както при Лаймската болест, така и при Епщайн-Бар, Цитомегаловирус, херпесните вируси и други вътреклетъчни патогени, диагностиката е решаващата стъпка към успешното справяне с инфекцията и предизвиканите от нея усложнения. Затова ние препоръчваме високотехнологични, чувствителни и специфични диагностични методи като EliSpot.

EliSpot тест – насоки за диагностика

EliSpot тестът е разработен от Сесил Черкински през 1983 г. като метод за мониторинг на имунния отговор при хора и животни. Принадлежи към IGRA (Interferon-Gamma-Release Assay) системите.

EliSpot е много подобен на ELISA и се основава на същия имунохимичен принцип тип „сандвич“. Основната разлика е, че ELISA определя общата концентрация на секретиран цитокин или антитяло, докато EliSpot открива количеството на активирани  клетки, които секретират сигнални производни. 

Препоръчително е EliSpot да се използва в допълнение към ELISA, защото е 200 пъти по-чувствителен, и дава отговор дали действително е налице активна инфекция. Той превъзхожда и RT-PCR анализа, тъй като открива количеството активирани клетки още в най-ранните етапи на инфекцията. А това може да е решаващо за навременно излекуване, особено при Лаймска болест.

EliSpot тест намира приложение при диагностиката на следните патогени:

• Borrelia burgdorferi, като включва следните антигени:
• Borrelia burgdorferi пълен антиген
• Пептид-микс от Borrelia burgorferi
• Borrelia burgdorferi LFA-1
• Borrelia miyamotoi
• Anaplasma&Erlichia
• Bartonella henselae
• Babesia microti
• Chlamydia pneumoniae
• Chlamydia trachomatis
• Mycoplasma pneumoniae
• Yersinia
• Epstein Barr Virus (EBV)
• Herpes Simplex Virus I&II (HSV 1/2)
• Cytomegalovirus (CMV)
• Varizella Zoster Virus (VZV)
• Candida albicans
• Aspergillus Peptide Mix 1 & 2

Допълнителна информация за теста, пробовземане и цени може да получите на телефон 02 953 13 87, по имейл или на Facebook страницата ни.

Използвани ресурси 

1. Thakur, A., Mikkelsen, H., & Jungersen, G. (2019). Intracellular Pathogens: Host Immunity and Microbial Persistence Strategies. Journal of immunology research, 2019, 1356540. https://doi.org/10.1155/2019/1356540
2. Evolution of Intracellular Pathogens Arturo Casadevall Annual Review of Microbiology 2008 62:1, 19-33 https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.micro.61.080706.093305 
3. Casadevall, A, Fang, FC. The intracellular pathogen concept. Mol Microbiol. 2020; 113: 541– 545. https://doi.org/10.1111/mmi.14421 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/mmi.14421 
4. Emilie Bourdonnay, Thomas Henry (2016) Intracellular Bacteria: Catch me if you can eLife 5:e14721 https://doi.org/10.7554/eLife.14721 
5. Selective treatment of intracellular bacterial infections using host cell-targeted bioorthogonal nanozymes Joseph Hardie , Jessa Marie Makabenta (…) DOI: 10.1039/D1MH02042K (Communication) Mater. Horiz., 2022, 9, 1489-1494 https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2022/mh/d1mh02042k 
6. Christoph Dehio, Colin Berry, Ralf Bartenschlager, Persistent intracellular pathogens, FEMS Microbiology Reviews, Volume 36, Issue 3, May 2012, Page 513, https://doi.org/10.1111/j.1574-6976.2012.00336.x 
7.  Longitudinal analysis reveals high prevalence of Epstein-Barr virus associated with multiple sclerosis. Bjornevik K, Cortese M, Healy BC, Kuhle J, Mina MJ, Leng Y, Elledge SJ, Niebuhr DW, Scher AI, Munger KL, Ascherio A. Science. 2022 Jan 21;375(6578):296-301. doi: 10.1126/science.abj8222. Epub 2022 Jan 13. PMID: 35025605. https://www.nih.gov/news-events/nih-research-matters/study-suggests-epstein-barr-virus-may-cause-multiple-sclerosis 
8.  Gequelin, L. C., Riediger, I. N., Nakatani, S. M., Biondo, A. W., & Bonfim, C. M. (2011). Epstein-Barr virus: general factors, virus-related diseases and measurement of viral load after transplant. Revista brasileira de hematologia e hemoterapia, 33(5), 383–388. https://doi.org/10.5581/1516-8484.20110103 
9.  Epstein-Barr virus and autoimmune diseases https://www.nih.gov/news-events/nih-research-matters/epstein-barr-virus-autoimmune-diseases 
10. Transcription factors operate across disease loci, with EBNA2 implicated in autoimmunity. Harley JB, Chen X, Pujato M, Miller D, Maddox A, Forney C, Magnusen AF, Lynch A, Chetal K, Yukawa M, Barski A, Salomonis N, Kaufman KM, Kottyan LC, Weirauch MT. Nat Genet. 2018 Apr 16. doi: 10.1038/s41588-018-0102-3. [Epub ahead of print]. PMID: 29662164.